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槐糖脂的屬性:脂肪酸底物和混合比例的影響——材料和方法
來源:上海謂載 瀏覽 1016 次 發(fā)布時間:2021-11-17
材料和方法
材料
所有培養(yǎng)基成分均從Sigma-Aldrich化學(xué)公司購買,但由Fluka Biochemika(瑞士Buchs)經(jīng)銷的酵母提取物除外,且所有溶劑均為HPLC級,并從Burdick和Jackson(密歇根州Muskegon)處購買。
槐脂合成
在假絲酵母生長培養(yǎng)基(CGM)中制備假絲酵母ATCC 22214接種物,該培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成(g/l):葡萄糖,100;酵母抽提物,10;和尿素,1,根據(jù)先前公布的方法(Ashby等人,2005年)。在2.5升臺式發(fā)酵罐(Bioflo III間歇式/連續(xù)式生物反應(yīng)器,新澤西州新不倫瑞克)中,在2升培養(yǎng)基中進行槐脂合成?;維L生產(chǎn)培養(yǎng)基(CGM培養(yǎng)基)由上述相同成分和相同比例組成。用濃鹽酸將pH值調(diào)至6.0,并通過高壓滅菌對CGM培養(yǎng)基進行滅菌。滅菌后,將溫度平衡至26℃,并將棕櫚酸、硬脂酸、油酸或亞油酸作為脂質(zhì)共基質(zhì)以2%(w/v)的比例添加到培養(yǎng)基中,使每個培養(yǎng)基在接種前的最終pH值為5.8±0.2。添加棕櫚酸和硬脂酸作為不溶性固體,而添加油酸和亞油酸作為不混溶液體。將50 ml冷凍接種培養(yǎng)物解凍并用于接種每次發(fā)酵。生長/生產(chǎn)條件如下:溫度=26-C,攪拌(葉輪轉(zhuǎn)速)=700 rpm,空氣流量=2 l空氣/分鐘,無pH控制。2天后,向發(fā)酵液中添加額外的5%(w/v)干葡萄糖和2%(w/v)脂肪酸,當(dāng)添加額外的0.5%(w/v)脂肪酸時,允許發(fā)酵持續(xù)5天。然后繼續(xù)發(fā)酵2天(發(fā)酵的總持續(xù)時間為7天)。
槐脂的分離純化
為了分離SLs,將整個培養(yǎng)物(細(xì)胞和肉湯)分成等份,并凍干(*2天)。將干燥的殘留物放入1 l錐形燒瓶中,通過在250 rpm、30-C下?lián)u晃2天,用過量的乙酸乙酯提取每部分。在整個提取過程中,定期移除50 ml乙酸乙酯,并通過TLC測試內(nèi)酯相對于開鏈形式的優(yōu)先溶解度的可能性(過程見下文)。提取物通過Whatman 2號濾紙過濾,剩余固體用乙酸乙酯洗滌兩次(每次500 ml),以最大限度地提高回收率。通過蒸發(fā)濃縮含有SLs的合并乙酸乙酯餾分,并將其添加到1 l己烷中以沉淀純SLs。通過過濾從己烷中回收純SLs,并在干燥器中真空干燥以獲得細(xì)白色粉末,然后精確稱量以獲得產(chǎn)品產(chǎn)率。
槐脂分析
使用硅膠板(250 lm層厚,17 lm粒徑,60 A?孔徑(Sigma-Aldrich)和氯仿/甲醇/水(80:20:1,體積比為溶劑)通過薄層色譜法闡明SL在乙酸乙酯中的優(yōu)先溶解度和分餾。顯影劑為乙醇中的5%(w/v)磷鉬酸,然后炭化。
如前所述測定SL含量(Nun?ez等人,2001)。簡言之,SL混合物通過HPLC使用Waters 2690分離模塊(Waters公司)使用15 cm 9 2.1 mm對稱C18 3.5 lm柱進行分離。使用線性梯度洗脫法從水/乙腈(0.5%甲酸)/乙腈(50:10:40,體積比)中進行洗脫并在25分鐘內(nèi)將其與乙腈(0.5%甲酸)/乙腈(10:90,體積比)保持5分鐘,總運行時間為35分鐘。流速為0.25 ml/min。將流出物連接到帶有APCI探針的微型質(zhì)量ZMD質(zhì)譜儀(水)設(shè)置為正模式,每次掃描2秒,從m/z 200掃描到m/z 1000。電暈針電壓調(diào)整為3.8 kV,樣品錐20 V,提取錐2 V,用于檢測碎片和分子離子([m]+)。
表面活性測定
在滴體積Kru–ss DVT30張力計(Kru–ss USA,北卡羅來納州夏洛特)上測量油水界面張力(IFT)。水相含有200mg表面活性劑/l,0.01M Na2SO4,0.77mm CaCl2,0.26mm MgCl2,pH值8.0。油菜(菜籽)油用作油相。在10微升油/分鐘時記錄三次測量的平均值。使用Kibron Delta-8張力計(Kibron Inc.,芬蘭赫爾辛基)測定臨界膠束濃度(CMC)和最小表面張力(min.ST)。樣品溶液含有0.01 mNa2SO4、0.77 mM CaCl2、0.26 mM MgCl2和各種濃度的表面活性劑,pH值為8.0。所有物理性質(zhì)測量均在室溫下進行。