膜蛋白是一種位于細(xì)胞膜上的蛋白，主要分為外周膜蛋白和跨膜蛋白兩大類。膜蛋白具有重要的生物功能，如控制能量轉(zhuǎn)換、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、控制物質(zhì)運(yùn)輸、維持細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)等，因此膜蛋白一直是研究熱門，是當(dāng)前近70%的藥物靶標(biāo)。

想要研究更具體膜蛋白結(jié)構(gòu)或者功能特性，我們首先要提取純化相應(yīng)的膜蛋白。接下來(lái)以一篇經(jīng)典Nature文章為例，解析如何提取純化膜蛋白。

2019年Nature文章：人的T cell receptor–CD3復(fù)合體結(jié)構(gòu)研究

純化思路：

（1）重組蛋白的構(gòu)建：

以哺乳細(xì)胞HEK293F為表達(dá)宿主，在C末端依次加了Strep和His標(biāo)簽。

目的基因：TCRα，TCRβ（pCAG)+CD3γ、δ、ε、ζ（pcDNA3,4）。

（2）重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：

在37℃、含有5%CO2條件下，120 rpm培養(yǎng)60 h。

（3）細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的制備和溶解：

通過(guò)離心收集細(xì)胞，然后勻漿破碎。

細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組份的收集：用25 mM HEPES，pH 7.5,1 M NaCl緩沖溶液重懸，加入1mM PMSF，100,000g超速離心30 min收集細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組份。

細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的溶解：用25 mM HEPES，pH 7.5,150 mMNaCl，1%DDM，0.2%cholesteryl hemisuccinate tris salt,1 mM PMSF,4℃條件下溶解2 h。

40,000g離心30 min，收集上清，即為可溶的膜蛋白粗溶液。

（4）親和層析純化：

本文作者用StrepTactin填料進(jìn)行純化。

結(jié)合條件：4℃結(jié)合3 h；

Wash buffer:25 mM HEPES，pH 7.5,300 mM NaCl,0.06%digitonin;

Elution buffer:25 mM HEPES,pH 7.5,150 mM NaCl,0.06%digitonin+4 mM desthiobiotin

圖1親和層析后，各個(gè)亞基的SDS-PAGE圖

（5）膜蛋白復(fù)合體交聯(lián)

蛋白質(zhì)濃縮后用0.1%(v/v)的戊二醛交聯(lián)40min，得到膜蛋白復(fù)合體。

（6）凝膠過(guò)濾分子篩層析：

用Superose 6 increase 10/300,buffer為25 mM HEPES,pH 7.5,150 mM NaCl,0.06%digitonin

圖2 TCR-CD3復(fù)合體SDS-PAGE圖

膜蛋白復(fù)合體TCR-CD3交聯(lián)后進(jìn)行凝膠過(guò)濾分子篩層析，進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)得到比較純的復(fù)合體。

（7）TCR-CD3結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)冷凍電鏡分析，TCR–CD3復(fù)合物的最終原子模型包含全長(zhǎng)TCRαβ的亞基，完整的ECD和跨膜螺旋CD3γε，CD3δε和CD3ζζ

圖3 TCR–CD3復(fù)合體結(jié)構(gòu)圖

看完大佬的實(shí)驗(yàn)框架，是不是頓時(shí)對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)也有了一些思路？

總結(jié)一下，膜蛋白的一般研究流程：

藍(lán)色背景分別是表達(dá)系統(tǒng)與去垢劑的選擇，是整個(gè)流程中至關(guān)重要的步驟。

膜蛋白的表達(dá)系統(tǒng)：原核表達(dá)（大腸桿菌、紅桿菌屬）、哺乳細(xì)胞（HEK293F）、酵母表達(dá)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)。不同的表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)下圖。

去垢劑的選擇：去垢劑別名表面活性劑、乳化劑、肥皂等等，分為離子型、非離子型和兩性離子型三類。去垢劑是同時(shí)具有親水性和疏水性基團(tuán)的雙極性分子，能夠使磷脂雙分子層解體并釋放膜蛋白，并且為去膜狀態(tài)下的膜蛋白提供穩(wěn)定的疏水環(huán)境。去垢劑也需要篩選合適的種類和濃度，各自優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)下圖。

蛋白純化：使用親和+凝膠過(guò)濾（分子篩）即可完成膜蛋白的純化流程。膜蛋白純化由于含有去垢劑的存在，離子交換不作為第一選擇。

操作TIPS

一、膜蛋白分離

1、膜蛋白的內(nèi)源表達(dá)通常來(lái)說(shuō)是比較低的，如果要提高產(chǎn)量可以通過(guò)重組膜蛋白的過(guò)表達(dá)，可以選擇大腸桿菌，酵母，哺乳動(dòng)物或者無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系。然而，外源表達(dá)的翻譯后修飾例如糖基化，磷酸化和乙?；吞烊坏鞍椎牟煌赡軙?huì)導(dǎo)致重組蛋白的某些活性下降（原核表達(dá)沒(méi)有翻譯后修飾系統(tǒng)），可以考慮通過(guò)對(duì)組成修飾的氨基酸進(jìn)行位點(diǎn)突變來(lái)改善。

2、跨膜蛋白具有較高的疏水性，經(jīng)常需要高濃度的去垢劑來(lái)幫助溶解。此外，膜蛋白也溶液形成聚集體，甚至是在去垢劑存在的情況下，會(huì)影響下游純化效率。去垢劑的選擇也會(huì)影響下游純化步驟的效率。例如，在帶有電荷的去垢劑存在的情況下不適合使用離子交換層析；而在有去垢劑的情況下也不適合使用疏水層析。

3、一旦溶解之后，膜蛋白經(jīng)常會(huì)變得更易于被蛋白酶降解。因此添加蛋白酶抑制劑例如EDTA和PMSF是很重要的（如果下游使用普通Ni柱純化，不能使用EDTA）。

二、外周膜蛋白提取

外周膜蛋白可以使用相對(duì)溫和的技術(shù)來(lái)分離，破壞外周膜蛋白和細(xì)胞膜之間的靜電作用或者氫鍵，而不破壞整個(gè)細(xì)胞膜。通常使用的試劑參見(jiàn)表一。使用含有高鹽離子濃度的緩沖液進(jìn)行提取很有用因?yàn)樗麄儠?huì)降低膜蛋白和帶有電荷的脂質(zhì)之間的靜電相互作用。

在提取緩沖液提取10-30min后，剩下的膜雙層結(jié)構(gòu)和相關(guān)的膜內(nèi)蛋白可以被離心分離（30-60min，100,000xg），釋放的外周膜蛋白存在于上清液中。

三、跨膜蛋白的提取

為了溶解得到跨膜蛋白，破壞膜雙層結(jié)構(gòu)是必要的。通常使用去垢劑的方法。去垢劑是一種兩性分子，同時(shí)包含疏水和親水的部分，并且在水中會(huì)形成膠束。膠束是去垢劑親水頭向外，疏水頭向內(nèi)排列的聚集體形式。去垢劑溶解蛋白通過(guò)一端結(jié)合蛋白的疏水部分，另一端結(jié)合親水部分。去垢劑的選擇應(yīng)該足夠溶解膜蛋白而不會(huì)造成不可逆的變性。常見(jiàn)的去垢劑見(jiàn)表二。

當(dāng)篩選去垢劑時(shí)，要注意每個(gè)去垢劑的臨界膠束濃度（CMC）。CMC是指自由的去垢劑分子形成膠束結(jié)構(gòu)需要的濃度。因?yàn)槿芤合喈?dāng)于膜蛋白從細(xì)胞膜上去除進(jìn)入去垢劑膠束，所以CMC是蛋白提取所需的最低濃度。CMC值可參考表二。

四、去垢劑的篩選

為保證膜蛋白的溶解效率，需要對(duì)去垢劑類型及濃度進(jìn)行篩選：

去垢劑篩選條件建議

一般使用PBS或Tris buffer進(jìn)行去垢劑篩選

DDM常用作初始嘗試的去垢劑

CHAPS和digitonin被證明在畢赤酵母體系中的細(xì)胞膜溶解具有較好的效果

可以考慮多種去垢劑混合使用

一些脂質(zhì)、小的兩性物質(zhì)（如1,2,3-庚三醇）或目標(biāo)蛋白的一些已知配體可以提升膜的溶解效率

五、去垢劑快速篩選

FSEC用于表達(dá)條件和去垢劑的快速篩選。FSEC（Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography），又叫熒光檢測(cè)尺寸排阻色譜法。具體方法是將目的基因構(gòu)建在帶有GFP標(biāo)簽的融合表達(dá)載體上，進(jìn)行小量表達(dá)。通過(guò)不同的去垢劑溶解后，然后上樣微量色譜柱，使用AKTA系統(tǒng)的紫外，熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)（熒光檢測(cè)器需搭配）。由于目的蛋白帶有GFP標(biāo)簽，使用熒光檢測(cè)會(huì)顯示出熒光信號(hào)。通過(guò)峰型和峰面積我們可以檢測(cè)到蛋白表達(dá)和溶解情況。