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Delta-8 動物胃腸道體內(nèi)中藥物的溶解度的測定——材料和方法

來源:上海謂載 瀏覽 1074 次 發(fā)布時間:2021-11-26

材料和方法


材料


美沙拉秦(也稱為美沙拉秦或5-ASA,水溶性1.32 mg/ml,[11]log P 0.98[13])來自Sigma-Aldrich(英國多塞特),潑尼松龍(log P 1.59[14])來自塞文生物技術(shù)有限公司(英國伍斯特郡)。水、甲醇、不含過氧化氫的四氫呋喃和三氟乙酸從Fisher Scientific(英國拉夫伯勒)購買,為HPLC級。緩沖容量測定用NaOH和HCl的容量標(biāo)準(zhǔn)從Sigma-Aldrich處獲得。


胃腸組織


所有程序均由內(nèi)政部批準(zhǔn)(PPL編號70/6421),并根據(jù)英國1986年《動物(科學(xué)程序)法》進(jìn)行。豬的胃腸道是在切勒肉類有限公司(英國埃塞克斯)的屠宰場從新鮮殺死的雄性動物(大白種和長白種雜交,n=3,95–110千克,6個月)獲得的。成年新西蘭大白兔(n=6,2.1-2.3 kg,9-10周)和Wistar大鼠(n=8220-255 g,8周)購自英國哈蘭有限公司(英國牛津郡)。所有動物都可以自由飲水,并在處死前自由進(jìn)食:兔子,實(shí)驗(yàn)室飲食5322,添加維生素C(英國諾丁漢郡IPS);豬,Eltabreed Bingle母豬蛋糕-豬用復(fù)合飼料(ABN有限公司,英國彼得伯勒);大鼠,Teklad全球18%蛋白質(zhì)嚙齒動物飲食(哈蘭有限公司)。


胃腸液


所有測量均在從動物胃腸液中獲得的上清液上進(jìn)行。處死動物,將胃腸道分為胃、小腸、盲腸和結(jié)腸。如前所述,進(jìn)一步細(xì)分小腸和結(jié)腸。[6,12]將胃腸液轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?,然后?3200 rpm的轉(zhuǎn)速離心(德國漢堡Eppendorf AG 5415D離心機(jī))(~16 110×g rcf)保存20分鐘。上清液在–80°C下保存,直至分析。由于大鼠胃腸道的液體容量有限,根據(jù)解剖位置收集了8只大鼠的液體,包括胃、小腸(近端、中部和遠(yuǎn)端)、盲腸和結(jié)腸。這些液體的緩沖容量、滲透壓和表面張力的特征如下所述。還測定了藥物在這些液體中的溶解度。所有測量均以一式三份進(jìn)行。由于來自大鼠的液體的匯集性質(zhì),所述標(biāo)準(zhǔn)偏差代表分析變異性;然而,對于兔子和豬來說,它代表了動物間的變異性。


滲透壓


使用數(shù)字微滲透計(jì)(5R型)(德國柏林Hermann Roebling Messtechnik)測定胃腸液上清液的滲透壓,其中滲透壓是利用冰點(diǎn)降低理論測量的。每次測量使用100μl的體積。


表面張力


使用Delta-8管理軟件(版本3.8)控制的Delta 8張力計(jì)(芬蘭埃斯波Kibron公司)測量表面張力。使用DynePlates(為張力計(jì)設(shè)計(jì)的96孔板)進(jìn)行測量,每個孔中有50μl上清液。


pH值和緩沖容量


使用配有FC202電極的pH計(jì)(HI99161)測量GI上清液的pH值和緩沖容量,該電極用于測量粘性和半固體材料(Hannah Instruments,Bedfordshire,UK)。在pH值變化為0.5和1.0單位時,通過向胃腸液中的300μl上清液樣品中添加小份HCl(用于腸液)或NaOH(用于胃液)來測量緩沖液容量,以達(dá)到所需的pH值變化。然后使用以下方程式計(jì)算緩沖容量:

式中,Ma是酸的摩爾濃度,Va是酸的體積(單位:毫升),Vb是緩沖液的體積(單位:毫升),ΔpH是pH單位的變化。


溶解度研究


樣品處理和溶解度測量


過量的毒品(~20毫克強(qiáng)的松龍或~將15mg美沙拉秦)添加到含有200μl胃腸液上清液的微離心管(Eppendorf AG)中。然后將樣品置于振蕩?。ㄓ虿占觽惪财眨┲?,溫度保持在37°C,轉(zhuǎn)速為170 rpm。24小時后,以5000 rpm的轉(zhuǎn)速離心樣品(~4472×g rcf)在37°C下放置10分鐘(離心機(jī)5804R,Eppendorf AG)。將上清液依次轉(zhuǎn)移至離心過濾管(康寧Spin-X,0.22μm醋酸纖維素膜,從英國萊斯特郡費(fèi)希爾科學(xué)公司獲得),然后以5000 rpm離心(~4472×g rcf)在37°C下放置20分鐘(離心機(jī)5804R,Eppendorf AG)。在分析之前,取下等份濾液(50μl)并用1950μl流動相稀釋。該方法之前已經(jīng)過驗(yàn)證[11],以避免藥物在生物液體中降解或與過濾器結(jié)合而影響溶解度結(jié)果。


分析方法


使用先前報(bào)告的方法,通過配備紫外線檢測器(安捷倫科技1200系列,加利福尼亞州圣克拉拉)的反相高效液相色譜法測定樣品中溶解的潑尼松龍或美沙拉秦的量。[11]空白胃腸液樣品(來自“樣品處理和溶解度測量”部分的無藥物上清液)也以與測試溶解度的樣品相同的方式分析,以排除在藥物保留時間出現(xiàn)干擾峰的可能性??瞻讟悠芬耘c樣品相同的方式稀釋,過濾并隨后分析。色譜條件為:流動相(5%甲醇,95%水加0.05%三氟乙酸用于美沙拉秦,68.8%水,25%四氫呋喃和6.2%甲醇用于潑尼松龍);反相柱,水對稱性C8 5μm 4.6×250mm(美國馬薩諸塞州米爾福德沃特斯)用于潑尼松龍,5μm 250×4mm(德國達(dá)姆施塔特默克)用于美沙拉秦。美沙拉秦和潑尼松龍分別在228nm和254 nm處檢測,保留時間分別為7.0和9.9分鐘。兩種藥物的剩余分析條件相同(即:20μl注射量,124 bar和40°C柱溫下的流速為1 ml/min)。


統(tǒng)計(jì)分析


總體數(shù)據(jù)通過單向方差分析進(jìn)行分析,然后使用IBM SPSS Statistics 19(美國伊利諾伊州芝加哥SPSS Inc.)進(jìn)行Tukey事后分析,置信區(qū)間為95%。使用一元一般線性模型工具,結(jié)合Tukey事后分析,將物種和位置作為固定因素,事后結(jié)果的統(tǒng)計(jì)顯著性為P<0.05。

Delta-8 動物胃腸道體內(nèi)中藥物的溶解度的測定——摘要、介紹

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