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生物表面活性劑產(chǎn)生菌菌體密度、細(xì)胞疏水性與發(fā)酵液pH及表面張力的關(guān)系(一)

來(lái)源:大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 瀏覽 244 次 發(fā)布時(shí)間:2024-09-14

經(jīng)過(guò)一次、二次常規(guī)采油之后,遺留在地層的殘余油仍然占石油總量的60%~70%。如何最大限度地開(kāi)采出地下剩余的原油,已經(jīng)成為石油工業(yè)的重要任務(wù)。Zobell在1946年發(fā)表了利用微生物提高石油采收率的專利,并發(fā)現(xiàn)微生物提高石油采收率的機(jī)理之一是微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生了生物表面活性劑。產(chǎn)生表面活性劑的微生物種類很多,如酵母菌、真菌、細(xì)菌等。能以原油組分為碳源和能源產(chǎn)生生物表面活性劑的微生物,是微生物采油的首選菌種?,F(xiàn)已知的能應(yīng)用于微生物采油的菌種有近30個(gè)屬100多種。利用不同的培養(yǎng)基對(duì)不同的菌種進(jìn)行培養(yǎng)、馴化,獲得了可以產(chǎn)生大量表面活性劑、對(duì)稠油具有較強(qiáng)的分散、乳化作用的菌種。從污水中分離到的一株地衣芽孢桿菌可以耐受高溫和高濃度鹽,且對(duì)原油具有較強(qiáng)的乳化、增溶和降黏作用。Ghojavand等在兼性厭氧條件下篩選出耐高溫(60℃)、高礦化度(15%NaCl)的枯草芽孢桿菌,該菌對(duì)原油具有較強(qiáng)的降黏作用。研究生物表面活性劑產(chǎn)生菌在微生物采油過(guò)程中的生長(zhǎng)規(guī)律,探討其作用機(jī)理,對(duì)微生物采油技術(shù)的改進(jìn)和完善具有十分重要的理論和實(shí)際意義。


本研究通過(guò)原油平板培養(yǎng)法,篩選出3株生物表面活性劑產(chǎn)生菌,對(duì)各菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)和初步鑒定;測(cè)定各菌株在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液表面張力、pH、菌體密度和細(xì)胞疏水性等特征參數(shù);對(duì)各菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑組成進(jìn)行分析。


1材料與方法


1.1材料


1.1.1菌源


盤錦油田被原油污染的土壤。


1.2方法


1.2.1培養(yǎng)基及其制備方法


液體富集培養(yǎng)基(g/L):原油3.0,NaCl 3.0,NH4Cl 0.1,MgSO40.02,NaNO30.2,KH2PO40.1,K2HPO40.2,pH 7.0。于1.03×105Pa滅菌30 min。


平板富集培養(yǎng)基(g/L):原油3.0,蛋白胨5.0,瓊脂20.0,NaCl 3.0,NH4Cl 0.1,MgSO40.02,NaNO30.2,KH2PO40.1,K2HPO40.2,pH 7.0。于1.03×105Pa滅菌30 min。


平板分離及保藏培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖3.0,蛋白胨8.0,酵母膏3.0,KH2PO42.7,NaCl 5.0,瓊脂20.0,pH 7.0。于0.8×105Pa滅菌30 min。


種子培養(yǎng)基(g/L):NaCl 5.0,牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,pH 7.0,于1.03×105Pa滅菌30 min。


發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):KH2PO43.4,Na2HPO41.5,(NH4)2SO44.0,MgSO4·7H2O 0.7,酵母粉0.2,液體石蠟17,pH 7.0,于1.03×105Pa滅菌30 min。


1.2.2菌源微生物的富集


稱取土樣10 g,加入生理鹽水90 mL,振蕩均勻,靜止12 h。取上清液按10%接種量接種到液體富集培養(yǎng)基中,于30℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)3 d。連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次。


1.2.3生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離、篩選與鑒定


生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離、初篩:將液體富集培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水稀釋105、106、107倍,每個(gè)稀釋度取0.1 mL菌液涂布于平板富集培養(yǎng)基上,于30℃靜置培養(yǎng)4 d。將平板富集培養(yǎng)基上有乳化圈或噬油斑的菌落,進(jìn)一步在平板分離培養(yǎng)基上劃線分離純化,挑取單菌落保藏在斜面保藏培養(yǎng)基上。


生物表面活性劑產(chǎn)生菌的復(fù)篩:將斜面保存的初篩菌株接種在種子培養(yǎng)基中,于30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1~3 d,再以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量將種子培養(yǎng)液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,于30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。根據(jù)液體石蠟被乳化及發(fā)酵液表面張力的變化,篩選出產(chǎn)生物表面活性劑的優(yōu)勢(shì)菌株。


生物表面活性劑產(chǎn)生菌的鑒定:根據(jù)《伯杰氏(Berge)菌種鑒定手冊(cè)》對(duì)分離得到的部分菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定。


1.2.4生物表面活性劑提取與分析


1.2.4.1生物表面活性劑的提取


將發(fā)酵液用濾紙過(guò)濾除油,濾液于3 000g離心20 min除菌,取上清液加入等體積的氯仿和甲醇(體積比為2∶1)的混合液,萃取3次。將萃取后的有機(jī)相于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得表面活性劑粗品。


1.2.4.2生物表面活性劑的化學(xué)組成分析


將發(fā)酵液用濾紙過(guò)濾除油,濾液于3 000g離心20 min除菌,取上清液加入等體積氯仿和甲醇(體積比為2∶1)萃取所得有機(jī)相進(jìn)行薄層層析。以氯仿、甲醇和水(體積比為65∶15∶2)為展開(kāi)劑,以苯酚-硫酸試劑為顯色劑,顯棕色斑點(diǎn)為糖脂;以茚三酮試劑為顯色劑,顯紅色斑點(diǎn)為脂肽。


取150 mg樣品加入2 mol/L H2SO4,于100℃密封水解8 h,用BaCO3中和至中性,3 000g離心10 min,取上清液進(jìn)行薄層層析。以氯仿、甲醇和水(體積比為65∶15∶2)為展開(kāi)劑,以苯酚-硫酸試劑為顯色劑,以鼠李糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品。


薄層層析用硅膠板為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品silica gel 60 F254。


1.2.5生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)特性


菌體密度的測(cè)定:采用濁度法。移除發(fā)酵液上層油相,取發(fā)酵液3 mL,加入TritonX-100(0.2%)溶液0.5 mL,漩渦振蕩1 min,于3 000g離心20 min,倒掉上清液,用3 mL去離子水重懸菌體,以去離子水為空白,于600 nm測(cè)定菌懸液的光密度OD600,以此表示發(fā)酵液的菌體密度。


疏水性(BATH)測(cè)定:采用BATH測(cè)定方法。移除發(fā)酵液上層油相,取發(fā)酵液3 mL,測(cè)定OD′600。加入石油醚0.1 mL,振蕩1 min,靜置30 s,再振蕩1 min,于30℃水中靜置15 min,取下層液體測(cè)定OD600。細(xì)胞疏水性BATH=OD600/OD′600。


表面張力測(cè)定:采用表面張力儀(芬蘭Kibron公司)測(cè)定。將發(fā)酵液用濾紙過(guò)濾除油,濾液于3 000g離心20 min除菌,取上清液測(cè)定表面張力。


pH測(cè)定:采用pH3-3C精密pH計(jì)測(cè)定。將發(fā)酵液用濾紙過(guò)濾除油,濾液于3 000g離心20 min除菌,取上清液測(cè)定pH。



生物表面活性劑產(chǎn)生菌菌體密度、細(xì)胞疏水性與發(fā)酵液pH及表面張力的關(guān)系(一)

生物表面活性劑產(chǎn)生菌菌體密度、細(xì)胞疏水性與發(fā)酵液pH及表面張力的關(guān)系(二)