3、結(jié)果和討論

在表征脂肪酶對(duì)某些天然脂質(zhì)的底物特異性時(shí)，最常用的方法是基于乳化反應(yīng)體系，使用pH-stat法。雖然通過(guò)這種方法，我們可以得到酶對(duì)某些天然脂質(zhì)底物的酶活性，并且可以滿(mǎn)足酶對(duì)界面的需求，但反應(yīng)對(duì)底物和酶的需求是豐富的，當(dāng)?shù)孜锘蛎竷r(jià)格昂貴或不易獲得時(shí)，不適合評(píng)估酶的活性。這種方法的另一個(gè)限制是，對(duì)于乳化體系，不可能控制“界面質(zhì)量”，也不可能在恒定表面壓力下跟蹤脂肪酶的動(dòng)力學(xué)行為[10]。據(jù)報(bào)道，表面壓力可以通過(guò)橫向密度的變化以及脂質(zhì)組織和結(jié)構(gòu)的變化影響脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的形成，最終影響脂肪酶的立體選擇性、區(qū)域選擇性和底物選擇性[17-19]。因此，傳統(tǒng)的pH-stat法對(duì)活性檢測(cè)仍有一定的局限性。此外，由于不同天然磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的價(jià)格非常昂貴，因此沒(méi)有采用常規(guī)的活性測(cè)試方法。在此，使用小體積的酶和底物進(jìn)行單層技術(shù)，并在反應(yīng)過(guò)程中精確控制表面壓力，選擇單層技術(shù)來(lái)研究底物特異性。

圖1顯示了空氣-水界面上不同磷脂單層的π-A曲線(xiàn)形狀。這里測(cè)試的所有磷脂的π-A曲線(xiàn)的形狀都是在所有顯示的表面壓力下單一液體膨脹（LE）和液體冷凝（LC）狀態(tài)的特征。在壓縮時(shí)，單層經(jīng)歷了一個(gè)轉(zhuǎn)變，這被視為從LE（低于10 mN/m）到LC狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。在高分子區(qū)域，由于分子堆積的增加，表面壓力升高，但不改變單層膜的彈性。最后，單分子膜達(dá)到了一種更為濃縮的狀態(tài)，但在π-a等溫線(xiàn)的形狀中沒(méi)有明顯的崩塌點(diǎn)。對(duì)于這里測(cè)試的磷脂，它們都可以形成穩(wěn)定的膜，并表現(xiàn)出良好的壓縮性能，DOPC的表面壓力甚至達(dá)到57 mN/m。

在本研究中，為了獲得商業(yè)酶對(duì)各種天然磷脂的底物選擇性信息，并為實(shí)際應(yīng)用提供經(jīng)濟(jì)指導(dǎo)，商業(yè)酶直接使用，無(wú)需進(jìn)一步加工。此外，子階段使用的緩沖液pH值調(diào)整為5.0，與油脫膠工業(yè)中使用的實(shí)際反應(yīng)條件一致。基于上述π-A曲線(xiàn)，我們最終選擇在10 mN/m到30 mN/m的表面壓差下測(cè)試超乳糖酸酶對(duì)不同磷脂的活性。

圖2示出了使用各種磷脂作為水解底物獲得的詳細(xì)活性-表面壓力曲線(xiàn)?？梢钥闯觯傅乃饣钚愿叨纫蕾?lài)于表面壓力。然而，每種底物的活性曲線(xiàn)不同。發(fā)現(xiàn)基板PE、PS和CL的鐘形曲線(xiàn)具有特征性的最佳表面壓力值（圖2B、D、E）。在低于15 mN/m的表面壓力下，未檢測(cè)到基本酶活性。水解活性隨表面壓力的增加而增加。在25 mN/m的表面壓力下，觀察到PE、PS和CL的最大活性。然而，當(dāng)表面壓力高于25 mN/m時(shí)，所有這些磷脂的水解活性降低。與所有測(cè)試的底物相比，在25 mN/m的表面壓力下，PE的水解率最高，水解活性達(dá)到5272.31×10-11摩爾。cm-2。最小-1。mL-1。對(duì)于PI，在15 mN/m以下也沒(méi)有觀察到水解速率，但是，沒(méi)有觀察到鐘形曲線(xiàn)，并且隨著表面壓力從15 mN/m增加到30 mN/m，活性增強(qiáng)（圖2C）。對(duì)于PC，從10 mN/m到25 mN/m觀察到鐘形曲線(xiàn)，但在30 mN/m的表面壓力下，活性進(jìn)一步增加。隨著表面壓力從25 mN/m增加到30 mN/m，表面輪廓上的單層構(gòu)象可能發(fā)生了變化，導(dǎo)致活性增加。在本實(shí)驗(yàn)中，在測(cè)試的表面壓力范圍內(nèi)，SM沒(méi)有活性。從π-A曲線(xiàn)可以看出，在25 mN/m的表面壓力下測(cè)試的所有磷脂都處于液態(tài)冷凝狀態(tài)，沒(méi)有達(dá)到各自的坍塌壓力。在這種情況下，超卵磷脂酶對(duì)不同單分子磷脂膜的偏好順序?yàn)镻E>CL>PS>PI>PC。在這些條件下，SM沒(méi)有活性。Lecitase Ultra選擇性的詳細(xì)機(jī)制仍需闡明。

4、結(jié)論

利用單層技術(shù)，成功地表征了超乳糖酸酶對(duì)各種天然磷脂的底物特異性。在本研究中，除SM外，Lecitase Ultra對(duì)各種磷脂表現(xiàn)出廣泛的選擇性。在所有測(cè)試的磷脂中，觀察到對(duì)兩性磷脂PE的高度偏好。目前對(duì)Lecitase Ultra的研究為其底物選擇性提供了第一手信息，并為在原油脫膠或磷脂轉(zhuǎn)化過(guò)程中有效利用該酶提供了有利信息。

這項(xiàng)工作是由中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金（31471690,31401627）、中國(guó)廣東省科技計(jì)劃（2013B0510000 09）和中國(guó)廣州珀?duì)柪锔タ萍加?jì)劃（201610010074）提供的。作者聲明沒(méi)有利益沖突。

人物傳說(shuō)

圖1不同磷脂的表面壓力-面積等溫線(xiàn)。

圖2使用不同磷脂的卵磷脂酶超水解活性隨表面壓力的變化。在室溫下，在零級(jí)槽中進(jìn)行分析。緩沖液：50毫米檸檬酸緩沖液（pH值5.0）?；钚员硎緸閱挝粫r(shí)間、單位反應(yīng)室面積和“零級(jí)”槽中每毫升酶水解的底物摩爾數(shù)（摩爾數(shù)cm-2.min-1.mL-1）。