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應(yīng)用不同組裝的磷脂酰膽堿對(duì)牛精漿蛋白的隔離:一種新的技術(shù)方法——材料和方法

來源:上海謂載 瀏覽 893 次 發(fā)布時(shí)間:2021-12-20

2.材料和方法


2.1.材料


主要構(gòu)成重構(gòu)膜外小葉的脂質(zhì)購(gòu)自Avanti Polar Lipides(美國(guó)阿拉伯斯特市阿拉伯斯特市),并按接收時(shí)使用?;衔?-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(PC(16:0/22:6),分子量=806.1,純度>99%)和1-(1Z-十八烷基)-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿PC(P-18:0/22:6,分子量=818.2,純度>99%)作為氯仿溶液(10mg-mL)獲得?1).將PC(16:0/22:6)和P-PC(18:0/22:6)的儲(chǔ)備溶液稀釋至1.25 mg mL?1解決方案。以綿羊毛膽固醇(Chol,Mw=711.0,純度>98%)和雞蛋鞘磷脂(SM,Mw=386.7,純度>98%)為粉末。二者均以1.25 mg/mL的濃度溶解于氯仿(HPLC級(jí),法國(guó)瓦爾德魯伊爾Carlo Erba)?1.


低溫保護(hù)培養(yǎng)基由Trizma堿(173.0 mM)、一水合檸檬酸(70.0 mM)、果糖(56.0 mM)、甘油(6.4%;v/v)和抗生素(青霉素G鈉391 mg L)組成?1,硫酸鏈霉素856 mg L?1,鹽酸林可霉素204 mg L?1,硫酸大觀霉素四水合物585 mg L?1)(西格瑪-奧爾德里奇,法國(guó)圣昆廷法拉維爾)。將pH值調(diào)整為6.2,其滲透壓約為1300.0 mOsm。


2.2.低密度脂蛋白的提取


根據(jù)Moussa等人的方案,從蛋黃中提取低密度脂蛋白(LDL)[31]。提取后,將低密度脂蛋白濃縮提取物(22±0.5 g,相當(dāng)于8.36 g干低密度脂蛋白)在低溫保護(hù)介質(zhì)(100 mL)中稀釋。通過micro BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce,Thermoscitific,F(xiàn)rance)對(duì)LDL樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,得出8.9±1.0 mg-mL?1.LDL樣品中PC磷脂的含量是根據(jù)雞蛋中PC的自然比例(18.4 g PC/100 g干LDL)計(jì)算得出的,Givenbyonton等人[33]。它等于15.4克升?1份低密度脂蛋白樣品。LDL也含有一小部分PE(PC/PE 6:1)[33]。


2.3.精漿收集


從一頭Prim Holstein公牛身上收集牛精子,并立即以10000×g離心兩次,以回收上清液中的精漿。我們樣品的蛋白質(zhì)含量為88.5±5.0mg-mL?1,由micro BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce,Thermoscitific,法國(guó))測(cè)定。


2.4.脂質(zhì)體的制備


脂質(zhì)體由冷凍保護(hù)緩沖液中的卵磷脂提取物通過使用Avanti Polar Lipides(美國(guó)阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州)的微型擠出機(jī)擠出而制備。卵磷脂提取物由磷脂酰膽堿(73%)和磷脂酰乙醇胺(11%)以及甘油三酯和鞘磷脂等次要成分組成。提取物在低溫保護(hù)緩沖液中水合過夜,脂質(zhì)濃度分別為3.90 mg-mL?1(C1),7.28毫克/毫升?1(C2),14.56毫克/毫升?1(C3)和21.84毫克/毫升?1(C4)。然后在超聲波浴中對(duì)分散液進(jìn)行15分鐘的超聲波處理(Elmasonic S 30H,來自德國(guó)Singen Elma,功率為275W)。最后,在擠出機(jī)中擠出分散體(20次穿過100 nm的膜)。分布尺寸集中在120nm,Zeta電位值為?6毫伏。在BSP存在下引入的脂質(zhì)體量以重量表示(脂質(zhì)體分散體C1、C2、C3和C4分別為1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和6.55 mg的脂質(zhì))。不確定度為0.01 mg。


2.5.電泳


十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在還原條件下進(jìn)行。將精漿溶解在pH值為6.8的緩沖液中,該緩沖液由Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和溴酚藍(lán)0.4%組成,以獲得1mg mL?1解決方案。添加9%巰基乙醇v/v,并旋轉(zhuǎn)樣品,隨后在95°C下加熱5分鐘。然后,將10μL低范圍分子量標(biāo)準(zhǔn)品(試劑盒O6U-0511,來自法國(guó)Souffelweyrsheim的Euromedex)和10至25μL精漿裝載在15%聚丙烯酰胺凝膠(pH 6.8-Tris 0.5 M和SDS 0.10%)上,并與由Tris 0.025 M、甘氨酸0.192 M和SDS 0.1%組成的pH 8.3遷移緩沖液耦合。在20 mA時(shí)進(jìn)行電泳,并用考馬斯藍(lán)溶液G250對(duì)凝膠進(jìn)行染色。最后對(duì)染色凝膠進(jìn)行掃描,并使用Multi-Gauge軟件(2.0版,日本富士照片膠片有限公司)評(píng)估峰值強(qiáng)度。


2.6.表面活性測(cè)量


吉布斯膜(由精漿溶液擴(kuò)散到空氣-緩沖界面形成)的表面張力在安裝在朗繆爾天平(Microtoul XL-LB,Kibron Inc.,Helsinki,芬蘭)上的15孔板(帶特氟隆邊緣的鋁底多孔板)上測(cè)量,該天平配有高靈敏度傳感器(使用合金絲的Wilhelmy方法)。將該裝置置于固定在23°C的溫度控制區(qū)內(nèi),并用純蒸餾水(美國(guó)密理博公司的Milli-Q系統(tǒng))進(jìn)行校準(zhǔn)。測(cè)量精度為0.1 mN/m。將精漿放入第一個(gè)孔中,然后在下一個(gè)孔中用因子2稀釋,依此類推(每個(gè)孔的體積為300μL)。每種精漿提取物重復(fù)測(cè)量4次(n=2)。結(jié)果表示為所有測(cè)量的平均值。


蛋白質(zhì)膜的壓縮等溫線是在之前配備傳感器的朗繆爾槽(MicroTour XL-LB,Kibron Inc.,芬蘭赫爾辛基)上測(cè)量的。精漿首先在冷凍保存緩沖液(1/100)中稀釋,并在緩沖液表面逐滴(50μL)擴(kuò)散。平衡20分鐘后,在室溫(23°C)下記錄壓縮等溫線。


2.7.精子膜外小葉脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的重建


精子膜外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域如前所述重建[35]。朗格繆爾槽(302LL,NIMA技術(shù),英國(guó))被插入一個(gè)自制的手套箱上,放置在抗振動(dòng)臺(tái)上,用氬氣沖洗,以避免脂質(zhì)氧化。表面壓力的測(cè)量精度為0.1 mN/m,使用濾紙制成的一塊極板(英國(guó)肯特郡邁德斯通惠特曼國(guó)際有限公司生產(chǎn)的無灰惠特曼色譜紙)與電子天平相連。環(huán)境溫度固定在20°C。將所有燒瓶和注射器放入手套箱中,然后用氬氣脫氣1小時(shí),然后鋪展單層。朗繆爾天平的溫度由設(shè)置為40°C的循環(huán)水系統(tǒng)進(jìn)行恒溫控制。緩沖液表面的實(shí)際溫度為34°C。亞相由低溫保護(hù)介質(zhì)組成。將膽固醇、鞘磷脂、P-PC(18:0/22:6)和PC(16:0/22:6)的氯仿溶液以適當(dāng)?shù)哪柋龋?1:14:16:39)用25μL微型注射器(精確到0.5μL)逐滴涂于緩沖液亞相上(Hamilton Bonaduz AG,Bonaduz,Switzterland)。單層保持平衡10分鐘,然后以40 cm2/min的屏障速度開始?jí)嚎s。一旦達(dá)到目標(biāo)壓力(25 mN/m),通過調(diào)整可移動(dòng)屏障的表面積保持壓力恒定。由于單分子層在30 mN/m時(shí)不夠穩(wěn)定,這是與雙層中脂質(zhì)堆積密度相關(guān)的膜壓力[36],我們將目標(biāo)壓力降低到25 mN/m,其中單分子層更穩(wěn)定(見結(jié)果)。


一旦達(dá)到目標(biāo)壓力(25 mN/m),將其保持1000 s,然后使用彎曲針管將生物分子(LDL、BSP或脂質(zhì)體)溶液引入亞相。針頭彎曲遠(yuǎn)離針尖,并位于槽的底部,以便在壓縮的亞相下方進(jìn)行注射。之前將當(dāng)量體積(每種添加劑0.3 mL)移到屏障后面。注射生物分子后,監(jiān)測(cè)每個(gè)脂質(zhì)分子的面積變化,并表示為相對(duì)于初始值的變化(a/a=(a?A(t0)×100/A(t0)。它已經(jīng)被跟蹤了3000秒,相當(dāng)于冷凍保存前處理精液的時(shí)間。在這種恒壓模式下,生物分子插入脂質(zhì)單層導(dǎo)致膜壓力增加,而膜壓力通過增加表面積而降低。相反,如果生物分子導(dǎo)致脂質(zhì)單層溶解在亞相中,則表面積減小。重復(fù)所有數(shù)據(jù),偏差不超過表面積的5%。


2.8.低溫透射電子顯微鏡(Cryo TEM)


使用低溫插入式低溫固定裝置(美國(guó)加坦)制備用于低溫TEM觀察的試樣,其中一滴水懸浮液沉積在輝光放電多孔型碳涂層格柵(美國(guó)Ted Pella公司)上。然后,通過將含有試樣的液滴吸干到支撐碳膜孔上殘留的薄層液體上,制備TEM網(wǎng)格。通過將格柵快速插入液氮冷卻的液態(tài)乙烷中,使液膜玻璃化。玻璃化標(biāo)本安裝在Gatan 910標(biāo)本架(美國(guó)Gatan)中,使用CT-3500-cryotransfer系統(tǒng)(美國(guó)Gatan)將其插入顯微鏡中,并用液氮冷卻。然后從保存在玻璃質(zhì)冰中并懸浮在支撐碳基質(zhì)上的孔中的標(biāo)本獲得TEM圖像。


在低劑量條件下觀察樣品(<10 e?/A2),在?178°C,使用JEM 1230“Cryo”顯微鏡(日本Jeol),在80 kV下運(yùn)行,并配備LaB6燈絲。所有顯微照片均記錄在Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相機(jī)上。為確保觀察的良好重復(fù)性,從幾個(gè)樣品制備中采集了一系列超過50張的圖像,放大率不同。