摘要

研究了糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定堿性磷酸酶在不同表面壓力下在Langmuir磷脂單分子膜中的催化活性。將酶底物對(duì)硝基苯磷酸酯注入混合酶/脂質(zhì)Langmuir單分子膜的亞相。其水解產(chǎn)物隨后通過在Langmuir槽的單層亞相的410nm處原位監(jiān)測(cè)吸光度。通過單分子膜的側(cè)向壓縮，獲得了對(duì)應(yīng)于不同分子表面密度的幾種表面壓力。熒光顯微鏡觀察到的單分子膜的形態(tài)顯示，由于酶在混合酶/脂質(zhì)膜中的不均勻分配，存在三種不同類型的結(jié)構(gòu)域。催化活性受酶表面密度的調(diào)節(jié)，在達(dá)到18 mN/m的壓力之前，催化活性會(huì)增加，但當(dāng)平衡面內(nèi)彈性（表面壓縮模量）顯著增加時(shí)，催化活性會(huì)顯著降低，從而導(dǎo)致界面形態(tài)的改變。提出了一個(gè)通過脂質(zhì)/酶表面形態(tài)和酶在氣液界面的表面堆積來調(diào)節(jié)酶取向和催化活性的模型。這一結(jié)果可能對(duì)理解GPI錨定蛋白在生物膜中的酶活性調(diào)節(jié)有重要影響。

介紹

真核細(xì)胞含有幾種糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白質(zhì)，據(jù)信在各種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。1-9其中，來自多種來源的堿性磷酸酶（E.C.3.1.3.1）已在生物膜模型系統(tǒng)中得到深入研究，包括雙層、10-16 Langmuir單層、，16-19和Langmuir-Blodgett（LB）膜。13,21-24 GPI錨定在這些系統(tǒng)中對(duì)蛋白質(zhì)吸附和分布的重要性已得到公認(rèn)。1,12,14-20,22,25由于其疏水性，GPI錨不僅允許將蛋白質(zhì)并入生物膜模型，而且還提供了蛋白質(zhì)分子在某些稱為“筏”的聚集體中的異質(zhì)分布，13,16,26-34是由鞘脂和膽固醇組成的微結(jié)構(gòu)域，呈液態(tài)有序相31,35,36，由側(cè)液-液晶相分離。31,33,34

堿性磷酸酶已定位于糖脂富集的微結(jié)構(gòu)域6中，并顯示其自發(fā)插入到由含膽固醇的鞘磷脂酰磷脂酰膽堿組成的脂質(zhì)有序結(jié)構(gòu)域中。14此外，還報(bào)告了GPI錨定蛋白在由其他磷脂組成的系統(tǒng)中的吸附，例如二嘧磺酰磷脂酸（DMPA）、20二棕櫚酰磷絲氨酸（DPPS）、19二硬脂酰磷酰膽堿（DSPC）、17和二嘧磺酰磷脂酰膽堿（DMPC）。12,15在我們的實(shí)驗(yàn)室中，目前正在研究固定在DMPA單層和LB膜中的大鼠骨板中堿性磷酸酶的吸附和酶活性。20,22,23由GPI錨介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子界面排列，促進(jìn)底物進(jìn)入活性部位，活性部位似乎因酶表面密度增加而受阻。然而，表面填料也會(huì)影響這種阻礙。然而，在之前的工作23中，為了獲得與生物膜中發(fā)現(xiàn)的側(cè)向壓力兼容的LB膜，使用了約30 mN/m的表面壓力；對(duì)于較低表面壓力對(duì)催化活性的影響的研究尚未完成。此外，研究蛋白質(zhì)/磷脂的表面堆積如何同時(shí)影響酶的分布及其催化活性也同樣重要。這些研究可以通過在空氣/液體界面上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、使用受到可變側(cè)向壓縮的混合蛋白質(zhì)/脂質(zhì)Langmuir單分子膜以及通過進(jìn)行內(nèi)部酶活性測(cè)量來方便地完成。在這項(xiàng)工作中，我們研究了洗滌劑溶解形式的大鼠骨板堿性磷酸酶（DSAP）在DMPA/DSAP混合Langmuir單分子膜中在不同表面壓力下的催化活性。根據(jù)我們之前對(duì)DSAP/DMPA系統(tǒng)的研究以及在19（1mN/m）時(shí)觀察到的DSAP/DMPA混合單分子膜的特殊相變，選擇DMPA。通過熒光顯微鏡（FM）檢查混合單分子膜的表面形態(tài).據(jù)我們所知，沒有關(guān)于在混合脂質(zhì)/蛋白質(zhì)Langmuir單層原位測(cè)量GPI錨定蛋白質(zhì)的酶活性的可用數(shù)據(jù)。

分子表面包裝對(duì)于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調(diào)制作用的影響——摘要、介紹

分子表面包裝對(duì)于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調(diào)制作用的影響——材料和方法

分子表面包裝對(duì)于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調(diào)制作用的影響——結(jié)果和討論

分子表面包裝對(duì)于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調(diào)制作用的影響——結(jié)論、致謝！