合作客戶/
拜耳公司 |
同濟(jì)大學(xué) |
聯(lián)合大學(xué) |
美國保潔 |
美國強(qiáng)生 |
瑞士羅氏 |
相關(guān)新聞Info
-
> 應(yīng)用不同組裝的磷脂酰膽堿對(duì)牛精漿蛋白的隔離:一種新的技術(shù)方法——結(jié)論、致謝!
> 表面張力法和電導(dǎo)法對(duì)比測(cè)定表面活性劑臨界膠束濃度
> 分子表面包裝對(duì)于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調(diào)制作用的影響——結(jié)果和討論
> 通過柔性葉片流涂膜的超支化聚合物結(jié)構(gòu)——結(jié)論、致謝!
> 葡萄酒的眼淚形成原因究竟是什么呢?
> 表面張力儀的出現(xiàn)為多個(gè)行業(yè)領(lǐng)域解決重要問題
> 洗發(fā)水中的表面活性劑
> 納米顆粒對(duì)二元硝酸鹽表面張力和密度的影響
> 表面張力儀的優(yōu)點(diǎn)與參數(shù)
> lb膜分析儀能看見膜嗎?
推薦新聞Info
-
> 全自動(dòng)液滴界面張力儀研究聚合物種類和水質(zhì)對(duì)聚合物的界面黏性模量影響
> 衣康酸型反應(yīng)性表面活性劑在新型皮革化學(xué)品中的應(yīng)用研究進(jìn)展
> 溫度、鹽對(duì)辛基酚聚氧乙烯醚磺酸鹽的油-水界面行為的影響(二)
> 溫度、鹽對(duì)辛基酚聚氧乙烯醚磺酸鹽的油-水界面行為的影響(一)
> 電化學(xué)氧化對(duì)液態(tài)金屬表面張力的影響機(jī)制:表面張力可隨電位變化
> 雙季銨基鄰苯二甲酸酯基表面活性劑SHZ16和SHZ14表面張力等性能對(duì)比(二)
> 雙季銨基鄰苯二甲酸酯基表面活性劑SHZ16和SHZ14表面張力等性能對(duì)比(一)
> 蒙藥滴丸劑制備與表面張力有何關(guān)系?
> 磺酸基團(tuán)修飾水滑石LB復(fù)合薄膜自組裝機(jī)理及酸致變色特性(二)
> 磺酸基團(tuán)修飾水滑石LB復(fù)合薄膜自組裝機(jī)理及酸致變色特性(一)
脂質(zhì)納米粒與脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)差異及其形成機(jī)制
來源:百家號(hào) 藥物遞送 瀏覽 1780 次 發(fā)布時(shí)間:2022-09-13
脂質(zhì)納米粒(Lipid Nanoparticle,LNP)是一種將核酸物質(zhì)遞送至細(xì)胞的納米載體,由可離子化陽離子脂質(zhì)、中性輔助磷脂、膽固醇、PEG脂質(zhì)組成。制備過程采用乙醇注入法,將脂質(zhì)乙醇溶液與核酸物質(zhì)的酸性(pH=4)水性緩沖液迅速混合,在酸性條件帶正電的可電離脂質(zhì)與帶負(fù)電的核酸物質(zhì)靜電絡(luò)合形成納米粒;再以pH=7.4(高于陽離子脂質(zhì)的pKa)的水性緩沖液對(duì)納米粒進(jìn)行透析洗濾,形成完整的脂質(zhì)納米粒-核酸遞送系統(tǒng)。
文丨塔卡拉瑪干的白楊
一、mRNA-LNP的結(jié)
關(guān)于mRNA-LNP的結(jié)構(gòu)示意圖,在認(rèn)識(shí)上存在一定的差異,不同的期刊有不同的結(jié)構(gòu)示意圖,甚至同一期刊還有不同的結(jié)構(gòu)示意圖。
首先在是Nature系列期刊中,就存在兩種明顯不同的示意圖,有的mRNA-LNP示意圖是單層膜結(jié)構(gòu),而有的文章則描述為雙層膜結(jié)構(gòu)。Vaccines和Science期刊中描述的mRNA-LNP示意圖則類似于脂質(zhì)體結(jié)構(gòu),為雙分子層結(jié)構(gòu)。Biotechnology Advances和Journal of Controlled Release期刊則選用了單層膜的mRNA-LNP示意圖。
圖1 Nature系列期刊的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖
圖2 Vaccines和Science期刊的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖
圖3 Biotechnology Advances和Journal of Controlled Release期刊的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖
Moderna公司描述的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖,以及International Journal of Pharmaceutics和Advanced Drug Delivery Reviews期刊描述的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖則更為抽象,尤其是International Journal of Pharmaceutics期刊,描述了三種不同的結(jié)構(gòu)。
圖4 Moderna公司的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖
圖5 International Journal of Pharmaceutics和Advanced Drug Delivery Reviews期刊的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖
筆者認(rèn)為,mRNA-LNP的脂質(zhì)膜到底為單層結(jié)構(gòu)還是為雙層結(jié)構(gòu),目前的顯像技術(shù)尚不能完全區(qū)分和識(shí)別,但對(duì)LNP技術(shù)進(jìn)行溯源,可知其是在脂質(zhì)體的基礎(chǔ)之上發(fā)展而來,LNP有包載遞送核酸物質(zhì)的能力而脂質(zhì)體卻不能有效遞送核酸物質(zhì),主要的區(qū)別在于LNP擁有實(shí)心內(nèi)核,能更好地保護(hù)核酸物質(zhì)不提前降解和釋放。此外,mRNA-LNP具有的內(nèi)部核心,其實(shí)質(zhì)是可電離的陽離子脂質(zhì)與帶負(fù)電的核酸物質(zhì)靜電作用絡(luò)合形成復(fù)合體,被包載于內(nèi)部;倘若在不存在核酸物質(zhì)的情況下,可能形成的就是脂質(zhì)體,阿米卡星脂質(zhì)體吸入混懸液便是利用制備LNP微流控技術(shù)來生產(chǎn)的。
二、siRNA-LNP的形成機(jī)制
關(guān)于帶電荷脂質(zhì)和核酸物質(zhì)包裹形成納米粒,用于胞內(nèi)遞送的物理過程以及所形成的的結(jié)構(gòu),目前尚未有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。
以2018年8月10日FDA批準(zhǔn)的Onpartro(Patisiran)為例,其作為首款采用LNP遞送siRNA的產(chǎn)品,是諾貝爾獎(jiǎng)成果從概念走向臨床實(shí)際應(yīng)用的里程碑。LNP-siRNA遞送系統(tǒng)是通過快速混合溶解脂質(zhì)的乙醇溶液和pH=4.0的siRNA水性緩沖液,然后透析去除藥液中乙醇并調(diào)節(jié)pH=7.4,形成LNP-siRNA。通過低溫透射電鏡觀察到,LNP對(duì)核酸物質(zhì)的包載效率接近100%,內(nèi)部電子密度均勻。分子模型和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,LNP是具有包含核酸物質(zhì)核心的納米結(jié)構(gòu)。
圖6 LNP的電鏡圖和結(jié)構(gòu)示意圖
1、形成機(jī)制的研究
關(guān)于脂質(zhì)納米粒的形成,曾經(jīng)提出過一個(gè)“倒置膠束”(inverted micelles)假說,假說認(rèn)為可電離的陽離子脂質(zhì)先與核酸物質(zhì)締合形成反膠束結(jié)構(gòu),過量的可電離脂質(zhì)則形成“空”反膠束;反膠束和“空”反膠束締合形成疏水核,極性較大的脂質(zhì)成分(如DSPC)再對(duì)疏水核進(jìn)行包裹。然而,該假說并不能解釋脂質(zhì)納米粒制備過程中的某些特征現(xiàn)象,例如脂質(zhì)相和水相快速混合后的LNP-siRNA混懸液在pH=4.0時(shí)呈澄清透明,這表明此時(shí)脂質(zhì)納米粒復(fù)合物的結(jié)構(gòu)直徑小于30nm;以緩沖液透析置換后LNP-siRNA混懸液呈半透明,表明在此過程中形成了較大結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)納米粒,也說明脂質(zhì)納米粒的粒徑在該工藝過程中由小變大。
在此基礎(chǔ)上之上,不列顛哥倫比亞大學(xué)(Universityof British Columbia)教授彼得卡利斯(Pieter Cullis)對(duì)脂質(zhì)納米粒的形成過程進(jìn)行了深入的機(jī)制研究。Pieter Cullis教授在40多年前揭開了脂質(zhì)納米粒應(yīng)用的序幕,他的實(shí)驗(yàn)室為脂質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。
相關(guān)閱讀:詳解LNP作為藥物遞送技術(shù)的起源和專利糾紛
Pieter Cullis教授對(duì)Onpattro(首款上市的LNP產(chǎn)品)的處方進(jìn)行了考察,Onpattro的處方為可電離脂質(zhì)/DSPC/膽固醇/PEG化脂質(zhì)= 50/10/38.5/1.5(mol/mol),N/P=3。冷凍電鏡結(jié)果顯示,在pH=4的水溶液中,形成的是粒徑較小的澄清透明的脂質(zhì)納米混懸液;在緩沖液透析和置換的過程中,溶液的pH逐漸升高至7.4,受pH值的驅(qū)動(dòng),脂質(zhì)納米粒在中性水溶液中逐步融合,形成粒徑較大的脂質(zhì)納米粒,納米粒的中心形成多層堆疊的固體核心結(jié)構(gòu)。初步估算平均每36個(gè)小粒子聚集成一個(gè)脂質(zhì)納米粒。
此外還發(fā)現(xiàn),采用乙醇稀釋/快速混合技術(shù)制備LNP-siRNA,當(dāng)siRNA含量較高時(shí),表現(xiàn)為堆疊的小雙層結(jié)構(gòu),其中siRNA被包載于緊密相連的脂質(zhì)雙分子層之間;當(dāng)siRNA含量較低時(shí),堆疊結(jié)構(gòu)的比例降低,LNP-siRNA復(fù)合物系統(tǒng)則表現(xiàn)出siRNA雙層結(jié)構(gòu)和非晶態(tài)電子致密核的組合,這可能是由中性形式的可電離陽離子脂質(zhì)產(chǎn)生的油滴而形成。所得結(jié)論為:含可電離陽離子脂質(zhì)的LNP體系在pH=4時(shí)形成雙層結(jié)構(gòu),在pH=7.4時(shí)形成非晶態(tài)“固體核”結(jié)構(gòu)。
2、影響LNP形成的因素
使用帶電荷脂質(zhì)制備siRNA-LNP時(shí),正電荷與負(fù)電荷的數(shù)量比會(huì)影響納米粒的大小、穩(wěn)定性、電位等性能。在siRNA-LNP中,正電荷通常為具有可電離銨根(N)的陽離子脂質(zhì),而負(fù)電荷則為帶有大量磷酸根(P)的核酸分子,兩者可通過靜電吸附的方式結(jié)合在一起。因此,不合理的比例可能會(huì)導(dǎo)致粒徑過大、穩(wěn)定性差等缺陷。值得一提的是,在研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)N/P=1時(shí),pH中和后LNP的粒徑不會(huì)有較大改變;當(dāng)N/P=3或者6時(shí),LNP在pH=7.4的緩沖液中粒徑會(huì)變大。而永久陽離子脂質(zhì)(例如DOTAP)制備的LNP在任何pH緩沖液中都不具有固體核心結(jié)構(gòu)。
圖7 不同的N/P會(huì)影響LNP的粒徑
圖8 永久陽離子脂質(zhì)制備的LNP無固態(tài)核心
同時(shí)研究了siRNA的存在對(duì)LNP的形成機(jī)制和結(jié)構(gòu)的影響。在沒有siRNA存在的情況下,LNP脂質(zhì)分散體在pH=4.0的條件下快速混合形成粒徑較小的單層小泡;隨著PBS緩沖液的透析pH值升高至7.4,較多的可電離陽離子脂質(zhì)以中性形式存在,囊泡間的靜電排斥力降低,使得雙分子層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差囊泡間產(chǎn)生融合;當(dāng)小囊泡融合時(shí),PEG脂質(zhì)、DSPC和膽固醇被分割到越來越大的LNP單外層,而中性的可電離陽離子脂質(zhì)被分割到LNP的內(nèi)部并在LNP中心形成油滴相;當(dāng)外單分子層的PEG脂質(zhì)濃度足夠高時(shí),會(huì)抑制LNP之間的繼續(xù)融合,從而維持平衡態(tài)。值得注意的是,雖然平衡態(tài)粒徑的大小與PEG脂質(zhì)的濃度有關(guān),但其影響力比DSPC和膽固醇含量的影響要小得多。
圖9 無siRNA情況下LNP的形成
在有siRNA存在的情況下,最初是在緊密相連的脂質(zhì)單層之間形成包含siRNA的小囊泡;隨著pH值的升高,類似于不含siRNA的LNP,可電離脂質(zhì)電位的中和會(huì)誘導(dǎo)脂質(zhì)顆粒間的融合,這個(gè)過程受到復(fù)合物中PEG脂質(zhì)、DSPC和膽固醇的相分離限制;有科學(xué)家提出,這些脂質(zhì)沉積在表面單層,抑制脂質(zhì)顆粒進(jìn)一步融合。值得注意的是,高濃度乙醇(體積比不小于25%)會(huì)導(dǎo)致除單個(gè)脂質(zhì)分子的高交換率(與siRNA復(fù)合的陽離子脂質(zhì)除外),從而使得快速形成平衡結(jié)構(gòu);還需要指出的是,必須要有部分DSPC和膽固醇被分割在外單層,并且在pH=4時(shí)能維持更小結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,因?yàn)樵诤?.5 mol % PEG脂質(zhì)且沒有DSPC或膽固醇的體系中能觀察到非常大的微米級(jí)系統(tǒng);隨著pH的升高,納米顆粒經(jīng)歷的過程與不含siRNA時(shí)LNP的情況基本相同;可電離脂質(zhì)向中性形式轉(zhuǎn)化的過程更利于增加在LNP內(nèi)核中的融合和沉積。
圖10 有siRNA情況下LNP的形成
3、結(jié)論
LNP-siRNA復(fù)合物是通過快速混合-乙醇稀釋過程形成,該復(fù)合物并沒有顯示出倒置的膠束結(jié)構(gòu),其中siRNA以“醋栗小圓面包”(currant bun)的形式分散在LNP內(nèi)部。相反,siRNA與緊密貼合的脂質(zhì)雙層膜相關(guān),雙層脂質(zhì)膜固定住siRNA分子,分離到LNP的外圍。過量的可電離陽離子脂質(zhì)會(huì)形成一個(gè)無定形的脂質(zhì)核心,類似于含有一定量膽固醇的油滴相。
這些研究表明,在優(yōu)化的LNP-siRNA遞送系統(tǒng)中,不同種類脂類的比例可能會(huì)根據(jù)特定的可電離陽離子脂質(zhì)而變化。例如,使用KC2脂質(zhì)時(shí),膽固醇在疏水核中的有限溶解度表明,應(yīng)降低膽固醇含量以實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定的體系?;蛘撸黾覦SPC的用量可能會(huì)增強(qiáng)較小的LNP給藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性和活性。此前已有研究表明,較小的LNP-siRNA給藥系統(tǒng)不如較大的給藥系統(tǒng)有效。
三、脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米顆粒
脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒的關(guān)鍵差異,不僅在于他們各自的應(yīng)用不同,更主要在于他們自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)、組成和生產(chǎn)工藝存在差異。
從廣泛定義來講,脂質(zhì)納米粒是以脂質(zhì)形成的納米顆粒,這么劃分的話脂質(zhì)體也是一種脂質(zhì)納米粒。然而,在具體的科學(xué)研究中,脂質(zhì)納米粒是用來描述一種不同于脂質(zhì)體的特定類型納米粒。脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒的最大區(qū)別在于形態(tài),脂質(zhì)體是脂質(zhì)有序排列的雙分子層形成封閉囊泡,有親水的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu);脂質(zhì)納米粒則沒有親水空腔,相反,脂質(zhì)納米粒因?yàn)殛栯x子磷脂和帶負(fù)電的核酸物質(zhì)靜電絡(luò)合作用存在于內(nèi)部,形成的多層核心分散于脂質(zhì)層間。
在組成方面,主要成分大致相同,都含有脂質(zhì)和膽固醇,只是脂質(zhì)納米粒所用的脂質(zhì)中必須要有可電離脂質(zhì),而脂質(zhì)體對(duì)脂質(zhì)的種類沒有嚴(yán)格要求。但在各成分的比例方面,脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒存在較大差異,尤其是膽固醇的用量,以經(jīng)典的脂質(zhì)體產(chǎn)品DOXIL為例,HSPC:CHOL:DSPE-PEG2000=3:1:1;而已上市兩款mRNA新冠疫苗的組分中,膽固醇分別占比42.7%(Pfizer/BioNTech)和38.5%(Moderna),明顯高于脂質(zhì)體中膽固醇的含量。
圖11 脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒的差別
在生產(chǎn)工藝方面,脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒在上游的工藝和步驟是不同的,但下游的生產(chǎn)過程幾乎一致。傳統(tǒng)的脂質(zhì)體制備工藝,首先是脂質(zhì)相和水相形成粗脂質(zhì)體,再通過均質(zhì)或擠出工藝將粒徑控制在一定的范圍內(nèi);而脂質(zhì)納米粒是利用微流混合系統(tǒng)將脂質(zhì)乙醇溶液和核酸酸性水溶液快速混合,微流混合系統(tǒng)的連接頭可以在兩相混合對(duì)撞過程中控制粒徑。脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒下游的緩沖液置換工藝幾乎一樣,都是利用切向流動(dòng)過濾(Tangential Flow Filtration,TFF)技術(shù)進(jìn)行緩沖液的置換或純化,最后終端0.22μm濾膜過濾除菌。
圖12 切向流動(dòng)過濾技術(shù)示意圖
脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒同宗同源,脂質(zhì)體已在藥物遞送領(lǐng)域扮演重要角色,涉及到眾多適應(yīng)癥,而脂質(zhì)納米粒目前僅用于核酸物質(zhì)的遞送,希望其在技術(shù)的積累和開發(fā)下得到廣泛應(yīng)用。