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Delta-8臨界膠束濃度對(duì)于藥物在生物體內(nèi)的增溶性的重要性研究——實(shí)驗(yàn)部分

來源:上海謂載 瀏覽 1038 次 發(fā)布時(shí)間:2021-12-21

實(shí)驗(yàn)部分


化學(xué)制品。這些化合物要么在羅氏創(chuàng)新中心合成,要么從不同的商業(yè)來源購買。通過向1 L蒸餾水中添加4.86 g KH2PO4和2.02 g Na2HPO4(密蘇里州圣路易斯市西格瑪),制備pH值為6.5、0.05 M的磷酸鹽緩沖液,然后通過密理博Express PLUS過濾器(德國達(dá)姆施塔特密理博0.22μM)過濾。FaSSIF buffer準(zhǔn)備從SIF粉末(BioReavangtcom,Croydon,英國),根據(jù)一個(gè)詳細(xì)的協(xié)議。15


在水和FaSSIF介質(zhì)中的平衡溶解度。將精確稱量的約1 mg化合物干粉置于玻璃管中,并添加330μL緩沖液。然后將樣品超聲處理1小時(shí)(Branson 1210,Branson Ultrasonics,Danbury,CT),在室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí),并靜置過夜以平衡。第二天,檢查樣品的pH值,并通過MultiScreenHTS PCF過濾器(德國達(dá)姆施塔特密理博)過濾溶液。用0.05 M HCl/20%乙腈(v/v)稀釋濾液的等份,以生成三種不同的樣品:未稀釋和稀釋為1:10和1:100?;衔镄?zhǔn)曲線由在0.05 M HCl/20%乙腈(v/v)中稀釋的標(biāo)準(zhǔn)1 mg/mL二甲基亞砜溶液生成。校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品隨后通過LC進(jìn)行分析?紫外線?MS,如下所述。


溶解度增強(qiáng)SE計(jì)算為在FaSSIF和水性緩沖液中測(cè)得的溶解度比率(等式1):


表面活性測(cè)定?;衔镌贒MSO中連續(xù)稀釋超過12種不同濃度,并在pH值為6.5的0.05 M磷酸鹽緩沖液中添加至最終10%的DMSO含量。最終化合物濃度默認(rèn)范圍為10 nM至10 mM。在第二次實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于達(dá)到溶解度極限或需要對(duì)相關(guān)濃度范圍進(jìn)行解析以確定最佳參數(shù)的情況,定義了替代濃度范圍。樣品靜置10分鐘,以便在液體中平衡?空中接口。表面壓力分布在張力計(jì)(MultiPi WS1,Kibron Inc.,芬蘭赫爾辛基)上進(jìn)行,通過之前的測(cè)量(72.8 mN/m)對(duì)50μL等份樣品進(jìn)行校準(zhǔn)。通過對(duì)生成的等溫線進(jìn)行曲線擬合確定表面活性參數(shù),并根據(jù)經(jīng)典的空氣吉布斯熱力學(xué)理論進(jìn)行計(jì)算?水里,臉上。主要導(dǎo)出參數(shù)如下。(i)考:空氣?水分配系數(shù),來自等式2

式中,π對(duì)應(yīng)于表面壓力,C對(duì)應(yīng)于化合物濃度。(ii)CMC:對(duì)應(yīng)于最大表面壓力下平臺(tái)截距和曲線外推斜率的臨界膠束濃度(?π/?lnc)處于拐點(diǎn)(圖3)。(iii)ΔΔGam:式3中的兩親性


式中,R是理想氣體常數(shù),T是以開爾文為單位的溫度。(iv)As:界面面積,來自等式4



其中NA是阿伏伽德羅的數(shù)字。


電離研究。電離常數(shù)(PKA)是通過PrimuleSGA儀器(天狼星分析儀器有限公司,森林街,英國)分光光度法獲得的。在室溫下,以恒定流速將試驗(yàn)品的水溶液注入流動(dòng)的pH梯度中。監(jiān)測(cè)化合物紫外吸光度的變化,作為pH梯度的函數(shù),并在紫外波長處測(cè)定電離常數(shù),其中化合物吸光度的變化率達(dá)到最大值。通過按比例混合兩種流動(dòng)緩沖液(含10%/vol甲醇),建立pH梯度。緩沖液是弱酸和弱堿的混合物,在240 nm波長以上吸收不明顯。對(duì)于電離常數(shù)未經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的化合物,pKa是使用現(xiàn)有的公共和羅氏專利化合物訓(xùn)練的市售Moka-in-silico模型計(jì)算的。16


親脂性(logD)測(cè)定。在分配實(shí)驗(yàn)之前,在室溫下,辛醇和pH為6.5的25 mM磷酸鹽緩沖液相互飽和。將化合物作為10mM的DMSO儲(chǔ)備溶液添加到辛醇飽和磷酸鹽緩沖液中,得到100μM的樣品溶液。然后,將1.2 mL溶液通過密理博96深井過濾器(密理博,達(dá)姆施塔特,德國)過濾到Nunc 96深井板(Nalge Nunc International,Rochester,NY)中,并用200μL辛醇飽和磷酸鹽緩沖液稀釋至最終1.4 mL體積。將等分濾液(Vaq=150μL)轉(zhuǎn)移至羅氏公司生產(chǎn)的Teflon 96孔板上,并通過自動(dòng)液體處理系統(tǒng)覆蓋DIF管(瑞士Rapperswill Weidmann Plastics Technology AG),預(yù)涂?jī)煞N不同體積的辛醇(Voct=1和15μL;每種體積n=3)(Bio-RAPTR FRD,Beckmann Coulter,Brea,CA)或不含辛醇作為初始含水化合物濃度的參考(每種化合物n=2;Caq 0)。將分析試劑盒密封并在室溫下?lián)u動(dòng)過夜,直到達(dá)到分布平衡。從特氟隆板頂部拆卸DIF管后,使用LC測(cè)定平衡時(shí)(Caqeq)和初始條件下(Caq0)水相中的化合物濃度?紫外線?MS,如下所述。


根據(jù)公式5計(jì)算分配系數(shù)logD



式中,Vaq和Voct分別是培養(yǎng)板上的飽和水相和辛醇相體積。


對(duì)于一些pH值為6.5的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不可用的化合物,使用上述相同方法在pH值為7.4時(shí)測(cè)量logD,或使用計(jì)算程序Kow_clogP17或參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)logP值。在這種情況下,使用ADMET預(yù)測(cè)器logD vs pH模型版本6.1(加利福尼亞州蘭開斯特Simulations Plus,Inc.,Lancaster),基于參考文獻(xiàn)18中開發(fā)的模型,將logD或logP值和表2中列出的pKa數(shù)據(jù)作為輸入?yún)?shù),實(shí)現(xiàn)了pH值為6.5時(shí)logD的外推。


表2。測(cè)定了51種化合物的表面張力特性


高效液相色譜法分析化合物濃度?紫外線?MS樣品在安捷倫1260 Infinity(溶解度樣品)或安捷倫1290 Infinity(logD樣品)HPLC-MS系統(tǒng)(安捷倫科技,加利福尼亞州圣克拉拉)中進(jìn)行分析,該系統(tǒng)配備DAD檢測(cè)器和API單四重質(zhì)譜儀(安捷倫6140,加利福尼亞州圣克拉拉)。將樣品注入Kinetex XB 2.6μm、2.1×50 mm(溶解度樣品)或Kinetex XB 1.7μm、2.1×30 mm(logD樣品)分析柱(Phenomenex,Torrance,CA),在60°C下操作。流動(dòng)相由a(水)和B(乙腈)組成,均含有0.1%體積的甲酸。使用通用快速梯度,以1.5 mL/min(溶解度樣品)或1.0 mL/min(logD樣品)的流速進(jìn)行梯度洗脫。通過DAD檢測(cè)器后,將洗脫液引入電噴霧界面,保持以下源設(shè)置:毛細(xì)管電壓+3.5 kV,干燥氣體流量(N2)13 L/min,霧化器壓力60 psig,干燥氣體溫度350°C。偽分子離子強(qiáng)度積分,[M+H]+,在單反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)下獲取。對(duì)于logD樣品,通過注入1、3和5μL對(duì)照溶液完成MS數(shù)據(jù)的內(nèi)部校準(zhǔn)。如果UV靈敏度足夠,則使用適當(dāng)波長處的峰面積進(jìn)行計(jì)算。