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LB 膜分析儀——?簡(jiǎn)單Langmuir-Schaefer法制備蛋白質(zhì)納米孔膜

來(lái)源: 瀏覽 386 次 發(fā)布時(shí)間:2024-05-30

研究簡(jiǎn)介:選擇性和滲透率通過(guò)界面聚合,制備了頂層薄而致密的復(fù)合膜。雖然優(yōu)化這種膜是很先進(jìn)的,但在這種密集的選擇層上傳輸需要高跨膜壓力和高能量消耗。在細(xì)胞尺度上,生物膜滿足上述許多標(biāo)準(zhǔn)。生物膜將細(xì)胞或細(xì)胞組分分開,并且主要由厚度小于10nm的致密磷脂雙層組成。磷脂雙層包含膜蛋白,其使得信號(hào)傳遞和分子選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)膜。連接膜兩側(cè)的膜蛋白被稱為跨膜蛋白,并且一些跨膜蛋白(TP)形成納米孔。研究人員將鐵蛋白聚合物偶聯(lián)到超薄膜上,并通過(guò)蛋白質(zhì)變性形成納米孔。使用天然成孔跨膜蛋白代替鐵蛋白,合成了跨膜蛋白(TP)聚合物綴合物,其通過(guò)在Pickering乳液界面處的組裝和隨后的聚合物鏈的UV交聯(lián)轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的膜。提出了一個(gè)簡(jiǎn)單的方法集成到平面超薄膜的功能性跨膜蛋白(TP),這種策略是基于Langmuir技術(shù)和同雙官能團(tuán)交聯(lián)劑戊二醛,是一種有效的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑和已知的不影響蛋白質(zhì)構(gòu)象在許多情況下。在研究中,F(xiàn)huA分子在朗繆爾槽的空氣-水界面處鋪展。在用Langmuir槽的兩個(gè)可移動(dòng)屏障壓縮時(shí),形成致密的2D膜并通過(guò)戊二醛交聯(lián)穩(wěn)定。使用Langmuir-Schaefer方法將單層或多層交聯(lián)的FhuA膜轉(zhuǎn)移到各種基底材料上。


Kibron LB 膜分析儀的的應(yīng)用


用乙醇徹底清潔Langmuir槽,用Millipore純水沖洗,并填充磷酸鹽緩沖液。隨后,將Langmuir槽的屏障完全封閉,吸附的顆粒從空氣-水界面吸走,磷酸鹽緩沖液從屏障后面重新填充。重復(fù)該過(guò)程,直到在完全屏障壓縮時(shí)測(cè)量的清潔空氣-水界面的表面壓力的上升小于或等于0.05mN/m-1在典型的膜制造實(shí)驗(yàn)中,將50μL FhuA溶液(FhuA濃度為6.3×10-6 M的MPD緩沖液中)加入到反應(yīng)器中。平衡2小時(shí)后,將朗繆爾槽的屏障設(shè)置為以1 mm/min的速度運(yùn)動(dòng)將吸附的FhuA單層壓縮至25 mN/m的表面壓力,在保持表面壓力恒定的同時(shí),將1.76mL戊二醛溶液(50wt%的H2O溶液)加入到反應(yīng)器中。在空氣中干燥之前,將轉(zhuǎn)移的FhuA膜在MPD溶液(5%體積MPD的Millipore純水溶液)中通過(guò)浸漬三次來(lái)洗滌。平衡2小時(shí)后,Langmuir槽的屏障以1 mm min-1的速度運(yùn)動(dòng),將吸附的FhuA單層壓縮到25 mN m-1的表面壓力。在保持表面壓力不變的情況下,將1.76 mL戊二醛溶液(50 wt%in H2O,Sigma-Aldrich,USA)從Langmuir槽屏障后注入磷酸鹽緩沖亞相。交聯(lián)至少進(jìn)行2小時(shí),直到FhuA膜按照Langmuir-Schaefer方法轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的底物上。在空氣中干燥之前,將轉(zhuǎn)移的FhuA膜在MPD溶液(5 vol%MPD在Millipore純凈水中)中浸洗三次。


實(shí)驗(yàn)結(jié)果


介紹了一種制造超薄但機(jī)械穩(wěn)定的膜的新方法,該膜包含TP FhuA,其天然形成限定的納米孔。由于其厚度低和本研究中推斷的極高密度的集體對(duì)齊蛋白質(zhì),與常規(guī)納濾膜相比,這種膜具有非常高的水滲透性。由兩種不同的FhuA變體制成的膜反映了每種變體的分子性質(zhì),在此關(guān)于離子滲透性進(jìn)行了證明。我們的膜有潛力作為一個(gè)平臺(tái)技術(shù),允許定制膜根據(jù)個(gè)人的過(guò)程要求。膜制造使用了研究良好的Langmuir技術(shù)和一個(gè)共同的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑,這確保了良好的可擴(kuò)展性,著眼于未來(lái)的應(yīng)用。

圖1、跨膜蛋白FhuA的交聯(lián)2D膜片。a)使用β-桶蛋白FhuA(跨膜蛋白鐵羥酸鹽攝取蛋白組分A)的兩種變體。在FhuA WT中,軟木結(jié)構(gòu)域阻塞大部分孔內(nèi)部,而該軟木結(jié)構(gòu)域被生物技術(shù)去除以形成開孔變體FhuA?CVF電子伏特兩種FhuA變體具有相同的尺寸,并且其特征在于蛋白質(zhì)上部的親水性環(huán)區(qū)和蛋白質(zhì)下部的疏水性跨膜區(qū)。b)應(yīng)用Langmuir技術(shù)形成超大2D FhuA膜片。(i)由于它們的兩親性,當(dāng)擴(kuò)散到空氣-水界面時(shí),F(xiàn)huA分子占據(jù)很大程度上直立的取向。(ii)當(dāng)在朗繆爾槽的屏障之間緊密壓縮并與戊二醛交聯(lián)時(shí),F(xiàn)huA膜片可以通過(guò)重復(fù)的水平浸漬層疊在基底的頂部。c)由FhuA WT(左)或FhuA?CVF制成的膜的示意性俯視圖電子伏特d)FhuA膜在水和離子滲透方面進(jìn)行表征。

圖2、a)在空氣-水界面處的FhuA膜并轉(zhuǎn)移到基底上。(i)吸附,(ii)壓縮,和(iii)在膜制造期間從0.32nmol FhuA WT涂布在磷酸鹽緩沖液頂部測(cè)量的谷面積-時(shí)間曲線在(ii)和(iii)中,戊二醛的注射用箭頭標(biāo)記。B)相應(yīng)的BAM成像顯示(i)在高達(dá)30 mN/m的表面壓力下均質(zhì)的FhuA膜-1.(ii)表面壓力超逾30mN/m)(i)一個(gè)或(ii)兩個(gè)FhuA膜片的AFM圖像,所述膜片層疊在硅基底的頂部上(左半部分用注射器尖端刮去)。高度分布屬于圖像中的虛線,并且指示(i)5和(ii)9 nm的膜厚度。d)單個(gè)FhuAΔCVF的共聚焦熒光顯微鏡圖像,用熒光標(biāo)記物標(biāo)記的硅襯底上的薄膜片e)獨(dú)立地覆蓋TEM網(wǎng)格(淺灰色)的結(jié)構(gòu)化碳膜中的孔(深灰色)的FhuA WT膜的HIM圖像。黑色區(qū)域顯示膜中的缺陷。

圖3、空氣-水界面處的FhuA膜BAM(布呂斯特角顯微鏡)圖。(a)在MPD緩沖液中擴(kuò)散FhuA WT之前和(b)之后的Langmuir槽氣-水界面BAM圖像;和(c-f)在不同表面壓力下的屏障壓縮。涂敷后立即在空氣-水界面上吸附一層致密均勻的FhuA WT膜。FhuA WT膜可以被壓縮到高達(dá)25 mN/m的表面壓力,而不會(huì)表現(xiàn)出不均勻性。在表面壓力為30 mN/m時(shí),在FhuA WT薄膜中可以看到垂直于壓縮方向的細(xì)長(zhǎng)裂紋。

圖4、在FhuA單層膜上的AFM測(cè)量.a)當(dāng)(i)未覆蓋和(ii)覆蓋有FhuA膜時(shí)在其中心具有單個(gè)孔的氮化硅膜窗口的示意圖.(iii)在PeakForce QNM模式下AFM成像期間FhuA膜涂覆的氮化硅膜窗口的橫截面(b-d)當(dāng)(b)孔未被FhuA膜覆蓋,(c)孔被破裂的FhuAΔCVF膜覆蓋時(shí),氮化硅膜窗口中的孔的AFM高度圖像膜,和(d)孔被一個(gè)完整的FhuAΔCVFtev膜層覆蓋(d)和(e)中的高度和變形圖像是同時(shí)獲得的,并且所有圖像都是在水中測(cè)量的。(d)和(e)中的高度和變形曲線分別屬于圖像中的虛線。

圖5、通過(guò)FhuA膜的水和離子滲透。a)覆蓋有氮化硅膜窗口的充水容器的示意圖,其用于測(cè)量FhuA WT膜的水滲透。由從杯內(nèi)到杯外的水蒸氣壓差驅(qū)動(dòng)(pi-p0)(a)中所示的杯子的照片。c)FhuA WT膜的水滲透性為3.87×104 mol Pa-1 m?2 s-1(空參考25.13×104 mol Pa-1 m?2 s-1誤差條表示至少三個(gè)樣品的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。d)用于測(cè)量FhuA膜的離子滲透性的實(shí)驗(yàn)裝置的示意圖。離子在電極之間擴(kuò)散的唯一方式是滲透氮化硅膜窗口中的孔頂部的FhuA膜。e)在磷酸鹽緩沖液(10×10?3 m NaCl,10×10?3 m恒定斜率對(duì)應(yīng)于4.0mS(空參比)、3.4mS(FhuA?CVF)、3.4mS(FhuA?CVF)和3.4mS(FhuA?CVF)的電極之間的恒定電導(dǎo).


總結(jié)


通過(guò)具有納米孔的膜的過(guò)濾通常與高跨膜壓力和高能量消耗有關(guān)。這個(gè)問題可以通過(guò)減少各自的膜厚度來(lái)解決。本研究描述了一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)制備基于蛋白質(zhì)納米孔的超薄膜,該膜具有優(yōu)異的透水性,比同類工業(yè)應(yīng)用膜高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)。此外,結(jié)合封閉或開放的蛋白質(zhì)納米孔可以調(diào)整膜的離子滲透性。為了形成這樣的膜,跨膜蛋白鐵羥酸鹽攝取蛋白組分A(FhuA)或其開孔變體在Langmuir槽的空氣-水界面組裝,壓縮成致密膜,通過(guò)戊二醛交聯(lián),并轉(zhuǎn)移到各種支撐材料上。這種方法可以制備具有高密度蛋白質(zhì)納米孔的單層或多層膜。通過(guò)原子力顯微鏡(AFM)、氦離子顯微鏡和透射電子顯微鏡可以看到覆蓋直徑達(dá)5μm孔的獨(dú)立膜。AFM最大推力定量納米力學(xué)性能映射(PeakForce QNM)表明,厚度僅為5 nm的獨(dú)立單層膜具有顯著的力學(xué)穩(wěn)定性和彈性性能。這種新型蛋白質(zhì)膜可以為節(jié)能納濾鋪平道路。